睡眠失調具有廣泛的健康後果，包括DNA損傷的累積。 墨西哥脂鯉（Astyanax mexicanus）為研究睡眠喪失的進化及其後果提供了一個強有力的模型。 該物種的多個洞穴適應種群已經獨立進化出比地表種群更少的睡眠，但卻沒有表現出健康壽命或壽命的明顯下降。 為了檢驗進化而來的睡眠減少是否與DNA損傷相關，我們比較了不同種群間的DNA損傷應答（DDR）和氧化應激。 洞穴魚在大腦中表現出升高的γH2AX水準和腸道中增加的氧化應激，這與慢性睡眠剝奪一致。 在急性紫外線照射后，地表魚增加了睡眠並啟動了光修復途徑，而洞穴魚則沒有。 從兩個種群衍生的成纖維細胞系證實了洞穴魚中DDR和修復能力的減弱，支援了急性DNA損傷應答的衰減。 轉錄組分析顯示，在地表魚中隨年齡差異表達的許多基因在洞穴魚中保持不變，這表明衰老相關通路的調控發生了改變。 總之，這些發現表明洞穴魚雖然經歷了睡眠剝奪的細胞標誌物升高，但對長期後果表現出韌性，這突顯了一個進化模型，可用於研究睡眠、DNA修復和健康衰老背後的機制。

引言

睡眠在動物王國中普遍存在，已在具有相對簡單神經網路的動物中被發現，包括從水母和線蟲到靈長類動物，這表明睡眠具有古老的功能和共同的進化起源（Aulsebrook等，2016;Joiner，2016;Keene和Duboue，2018;McNamara等，2009;Zimmerman等，2008）。 雖然睡眠的主要功能尚未完全理解，但它對許多過程至關重要，包括神經連接、有毒代謝物的清除、免疫、學習和記憶（Frank，2020;Hartmann，1973;Siegel，2005）。 越來越多的證據表明DNA損傷可能在睡眠驅動中發揮重要作用（Carroll等，2016;Vaccaro等，2020;Zada等，2021;Zada等，2019）。 DNA損傷與長時間清醒有關，並在包括線蟲、斑馬魚、小鼠和人類在內的眾多物種中在睡眠期間減少（Bellesi等，2016;Cheung等，2019;Goetting等，2020）。 相反，睡眠中斷與DNA損傷相關，睡眠剝奪（SD）抑制了人類DNA修復基因的表達（Carroll等，2016;Goetting等，2020），這表明睡眠對維持基因組完整性和功能具有關鍵作用，以及睡眠喪失與DNA損傷之間的關聯，可能導致神經退行性疾病。 此外，睡眠喪失導致腸道和/或大腦中活性氧（ROS）水準升高，這是DNA損傷的已知介質，在果蠅中導致死亡（Haynes等，2024;Vaccaro等，2020）。 睡眠喪失對腸道ROS產生的影響在小鼠中也存在（Vaccaro等，2020）。 儘管取得了這些進展，但對睡眠喪失的細胞後果或DNA損傷與睡眠調節之間的進化關係知之甚少。

通過考察進化衍生的睡眠差異的比較方法，已為理解睡眠調節的遺傳和功能基礎提供了重要見解（Allada和Siegel，2008;Cirelli，2009;Zimmerman等，2008）。 雖然大多數魚類睡眠研究使用斑馬魚，但墨西哥脂鯉Astyanax mexicanus是研究行為和生理特徵的遺傳和進化基礎的新興模型（Keene等，2015;Keene和Appelbaum，2019;Kowalko，2020;McGaugh等，2020a; Yoshizawa，2015）。 A. mexicanus以盲眼洞穴種群和現存地表種群的形式存在; 雖然地表和洞穴種群在地理上是隔離的，但它們仍可雜交並在自然和實驗室環境中雜交（Moran等，2023）。 在此系統中，地理和地質隔離的洞穴種群之間存在相似的睡眠喪失表型（Aspiras等，2015;Duboué等，2011），不同洞穴之間可能具有獨特的遺傳基礎（Duboué等，2011;Mack等，2021;Yoshizawa等，2015）。 此外，在迄今為止研究的三個洞穴種群中都已鑒定出DNA修復基因的進化差異，包括調節睡眠、光反應性和DNA修復的機制之間的聯繫（Beale等，2013;Mack等，2021）。 這些發現支援了睡眠的遺傳和分子基礎與洞穴魚中DNA修復過程密切相關。

考察導致睡眠調節進化變化的生態因素及其對這種睡眠喪失的生理後果，有可能解決睡眠的基本功能。 例如，在人類中，失眠與許多不同疾病和發病率增加相關，表明睡眠對健康衰老至關重要（Arble等，2015;Carroll和Prather，2021）。 令人驚訝的是，洞穴魚每體愛飛機杯 陰蒂高潮液 陰莖增大藥 陰莖增大膏 陰莖增大器 速效雙效藥 速效持久藥 速效勃起藥 迷情型藥 費洛蒙香水 聽話型乖乖水 男性用藥 男性外抹藥 淫汁水 昏睡藥 持久延時液 女性春藥 女性外塗 失憶型藥 增慾按摩油 天睡眠僅為1-2小時，而其地表對應物則每天睡眠6-10小時（Duboué等，2011）。 儘管睡眠顯著減少，但洞穴魚沒有表現出明顯的健康後果，這表明它們對睡眠喪失建立了韌性（Cobham和Rohner，2024;Riddle等，2018a; Rohner，2018）。 考慮到DNA斷裂水準的變化與果蠅、斑馬魚、小鼠和人類中的睡眠調節相關（Bellesi等，2016;Carroll等，2016;Zada等，2021），內在的DNA修復和DDR通路變化可能導致洞穴魚睡眠需求減少。

在此，我們試圖研究DNA損傷與睡眠進化之間的關係，以測試洞穴魚在細胞和有機體水準上是否具有慢性睡眠剝奪和加速衰老的標誌物。 我們發現洞穴魚大腦中的DNA損傷升高，這與睡眠喪失與DNA損傷水準升高相關的觀點一致。 洞穴魚對紫外線損傷的轉錄和行為反應減弱，洞穴魚細胞表現出減弱的DNA修復能力，這表明減弱的DDR功能可能是洞穴魚睡眠喪失的原因。 為了檢驗DDR減弱的長期後果，我們檢查了年輕和年老地表魚和洞穴魚的轉錄差異。 雖然地表魚中的衰老與跨組織類型的廣泛轉錄變化相關，但年輕和年老洞穴魚之間相對較少的轉錄差異。 總之，這些發現表明，儘管DNA損傷可能源於睡眠喪失，洞穴魚似乎已經發展出對衰老的分子韌性。

結果

在脊椎動物中，包括斑馬魚和A. mexicanus等硬骨魚類，DNA損傷啟動了一個高度保守和典型的應答和修復程式。 DDR蛋白的標誌物可以在細胞和整個有機體水準上定位和量化。 組蛋白H2AX在絲氨酸139位點的磷酸化（γH2AX）提供了對DNA雙鏈斷裂的細胞應答的既定且可量化的生物標誌物，這對修復複合物的組裝是必需的（Siddiqui等，2015）。 我們在ZT0時比較了地表魚和Pachón洞穴魚大腦中的γH2AX水平，此時兩個種群在行為上活躍且睡眠最少（圖1A-B和圖1—視頻1）。 與地表魚相比，洞穴魚的菱腦、端腦和中腦中的γH2AX水準升高（圖1C）。 這些發現表明，與地表魚相比，短睡眠的洞穴魚中DNA損傷升高。

睡眠喪失與腸道功能下降相關，包括ROS的累積（Vaccaro等，2020）。 為了檢查睡眠喪失的標誌物是否延伸到A. mexicanus的腸道，我們比較了地表魚和洞穴魚腸道中的ROS。 6天齡的魚在ROS標誌物二氫乙啶（DHE）中孵育，並在共聚焦顯微鏡下對腸道進行成像。 我們發現洞穴魚腸道中的ROS上調，這強化了這些短睡眠魚中細胞應激和DDR的典型標誌物升高的觀點（圖1D-G）; ROS水準在胃、小腸和大腸中升高，但在直腸中未升高（圖1G）。 成像前，地表魚和洞穴魚都在溫度控制的孵化器中培養，並僅依靠卵黃囊獲取營養; 因此，腸道ROS的差異不能歸因於培養或餵養條件的差異。 總之，這些發現加強了洞穴魚相對於地表魚腸道中細胞應激升高的觀點。

為了進一步檢查A. mexicanus中DNA損傷和睡眠之間的直接聯繫，地表魚和洞穴魚暴露於短時間的UV-B輻射中，已知這會導致DNA損傷並誘導雙鏈斷裂（Zada等，2021）。 在地表魚中，UV照射導致睡眠在長達3小時內呈劑量依賴性增加，類似於斑馬魚中的發現（Zada等，2021;圖2A和B）。 有趣的是，地表魚在夜間睡眠減少，可能是白天睡眠增加導致的睡眠信用的結果（圖2A; Öztürk-Çolak等，2020）。 地表魚睡眠量的增加由睡眠發作次數增加介導，在較高劑量下，睡眠發作長度也增加（圖2C和D）。 相反，UV處理對洞穴魚白天或夜間的睡眠沒有影響（圖2E-H）。

睡眠-覺醒概率的分析與這些測量結果一致，顯示地表魚在處理后3小時內睡眠壓力升高和覺醒壓力降低; 而在洞穴魚中，沒有變化（圖2—圖補充1）。 這些結果證實UV誘導的DNA損傷促進了A. mexicanus地表魚的睡眠，而這種反應在洞穴魚中喪失。

我們檢查了在明周期時間（ZT）0（光照開始）高劑量（60秒）UV處理對地表魚和洞穴魚轉錄反應的影響。 6天齡的魚在UV照射后90分鐘收穫用於RNA提取（圖3—圖補充1）。 RNA表達的PCA分析顯示，驅動樣本間轉錄反應變異的最大因素是種群，主成分1按種群分離樣本並解釋了86%的方差。 主成分2按處理分離樣本並解釋了9%的方差（圖3B）。 分析揭示了許多在兩個種群中差異表達的基因，包括RNA聚合酶調節轉錄因數fosl1a的上調和spi-c的下調（圖3C）。 許多基因選擇性差異表達，包括地表魚中熱休克蛋白hspb9的上調和洞穴魚中葡萄糖感測器gck的下調（圖3C，圖3—圖補充1）。 為了確定DDR通路是否在UV照射后在洞穴魚中激活，我們量化了地表魚和洞穴魚中通路成分的變化。 在地表魚中顯著上調的DNA修復基因的熱圖顯示，幾個DNA修復通路的成分在UV處理后的洞穴魚中差異表達（圖3D）。 值得注意的是，環丁烷嘧啶二聚體光解酶（cpdp），UV誘導DNA損傷光修復通路的重要組成部分，在地表魚中反應強烈，但在洞穴魚中沒有反應。 儘管先前的研究組報告說cpdp在成年洞穴魚中組成性上調（Beale等，2013），但我們的分析與這一發現不符; 然而，這可能是由於所研究的年齡或晝夜時間點的差異。 對先前洞穴魚晝夜轉錄組研究的更詳細分析顯示，兩個DDR基因在晝夜週期的某些階段升高，但並非所有階段（圖3—圖補充2）。 此外，xrcc3（人類rad51的旁系同源物，對同源重組很重要）和fan1（Fanconi貧血通路的組成部分）對洞穴魚中的UV-B處理沒有反應。 相反，ube2al（對複製后DNA修復必需）在洞穴魚中可能比地表魚更強地啟動。 總之，這些發現表明洞穴魚中的DNA修復過程經歷了複雜的變化，一些通路變得無功能，而其他通路可能被上調以補償其他區域的功能喪失。 為了更全面地理解UV-B處理導致的轉錄變化，對地表魚和洞穴魚進行了基因集富集分析（GSEA）。 大量通路在兩個種群中富集（圖3—圖補充1）; 為了檢查兩個種群轉錄反應之間的差異，我們識別了僅在地表魚或洞穴魚中富集的通路（圖3E）。 只有地表魚顯示出與ROS反應和細胞氧化還原穩態相關的基因的顯著啟動，這與洞穴魚中ROS升高的測量結果一致，而洞穴魚顯示出與代謝過程相關的基因的啟動和與突觸信號相關的基因的抑制，表明對DNA損傷的反應改變。

為了在細胞水準上量化DNA損傷，我們建立了從地表魚和Pachón洞穴魚胚胎衍生的成纖維細胞系（圖4—圖補充1）。 簡而言之，我們在受精后12小時內解離並滅菌胚胎細胞，並分離在40多次傳代中傳播的單個克隆。 為了確認細胞系確實代表成纖維細胞，我們用波形蛋白（已知的成纖維細胞標誌物）對細胞進行了染色（Satelli和Li，2011）。 兩個細胞系均表現出穩定的波形蛋白表達（圖4—圖補充1）。 我們通過RNA測序進一步驗證了細胞系的成纖維細胞性質，顯示與其他細胞類型（包括同一物種先前建立的肝源細胞系（Krishnan等，2022））相比，其他成纖維細胞特徵基因（如col1a1）的表達增強。

我們接下來使用新生成的成纖維細胞系來測量UV輻射暴露后的DNA損傷水準。 我們將細胞暴露於100 J/m² UV輻射下，並使用針對環丁烯嘧啶二聚體（CPD）的抗體可視化UV誘導的DNA損傷，作為DNA損傷標誌物。 地表魚和洞穴魚衍生的細胞系均表現出強烈的CPD誘導，表明明顯的UV誘導DNA損傷（圖4A）。 我們使用ImageJ的Cellpose功能量化了細胞核區域的平均螢光，發現兩個衍生細胞系之間沒有顯著差異（p=0.6404，雙向方差分析，圖4B）。

為了評估不同細胞系中相似水準的DNA損傷是否導致DNA損傷修復的變異，我們量化了UV處理后的γH2AX水準。 在暴露后每兩小時測量一次，持續6小時。 地表魚細胞顯示出γH2AX的明顯增加，而洞穴魚細胞系僅顯示出輕微上升，這意味著洞穴魚細胞的UV損傷修復能力減弱（圖4C和D）。 為了驗證這些結果，我們在肝源細胞系（Krishnan等，2022）上重複了這些實驗，並觀察到洞穴魚衍生細胞在輻射暴露后γH2AX水準降低的類似趨勢，而地表魚細胞顯示出強烈誘導（圖4—圖補充1）。 這種模式表明DDR差異不僅限於組織類型。 為了直接測試修復DNA的能力，我們採用了宿主細胞再激活測定法（Nagel等，2014;Tian等，2019）。 簡而言之，綠色螢光蛋白（GFP）質粒用600 J/m² UV處理。 我們將細胞系轉染完整或體外UV損傷的GFP質粒，並使用流式細胞術在50小時后跟蹤GFP螢光恢復，作為宿主細胞修復質粒能力的代理（圖4G）。 與γH2AX發現一致，UV損傷質粒轉染的洞穴魚細胞顯示出比地表魚細胞（相對於對照約49%）明顯更低的GFP信號恢復（相對於對照約22%）（圖4E和F）。 這些表明DNA修復能力減弱的觀察結果，與我們在UV處理的魚幼體中觀察到的睡眠行為差異一致。

大腦中的DNA損傷、腸道中的ROS和睡眠喪

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失與衰老相關（Carroll和Prather，2021;Maynard等，2015;Schumacher等，2021）。 雖然A. mexicanus洞穴魚進化出了許多對人類或其他物種有害的特徵，但有證據表明它們也進化出了代謝和生理韌性，使它們能夠享受與地表魚相似甚至延長的壽命（Lunghi和Bilandžija，2022;Medley等，2022;Riddle等，2018a）。 為了檢查大腦中DNA損傷長期累積、腸道ROS升高和睡眠喪失的影響，我們檢查了年輕和年老魚的組織轉錄譜。 簡而言之，我們解剖了年輕（約1歲）和年老（7-8歲）地表魚和Pachón洞穴魚的大腦、腸道、肝臟、肌肉和心臟。 大腦樣本的PCA分析顯示種群對樣本方差的強烈貢獻，樣本在PC1上按種群分離並解釋了51%的方差（圖5A）。 有趣的是，雖然地表魚樣本在PC2上按年齡分離，但洞穴魚中沒有按年齡分離樣本（圖5A）。 腸道中的基因表達也呈現出相同的趨勢（圖5—圖補充1）。 心臟和肝臟中基因表達的PCA圖在種群或年齡上均未顯示明顯分離，而肌肉組織顯示按種群分離，但不按年齡分離（圖5—圖補充1）。 為了檢查對更廣泛轉錄組的影響，我們比較了地表魚和洞穴魚年輕和年老種群之間差異表達的基因數量。 在所有組織中，地表魚在大腦、腸道、心臟、肝臟和肌肉中年輕和年老之間差異表達的轉錄本明顯多於洞穴魚（圖5B）。 總之，這些發現表明，儘管睡眠喪失、ROS升高和DNA損傷，洞穴魚的轉錄組對年齡相關變化表現出韌性。

我們試圖檢查地表魚和洞穴魚之間差異表達的特定基因，提供對DNA損傷和睡眠喪失韌性的潛在機制。 因為睡眠被認為是神經元DNA損傷修復所必需的，我們首先檢查了衰老地表魚和洞穴魚大腦中的轉錄差異。 在大腦中，只有五個基因在兩個種群中都顯示出顯著變化; 其中包括基因top2a，在兩個種群中均減少（圖5C）。 Top2a被認為是染色體結構維持在細胞分裂過程中所必需的。 有趣的是，GSEA分析沒有揭示衰老地表魚大腦中任何顯著富集的通路，儘管差異調控基因數量很高，而衰老洞穴魚大腦顯示出與染色體凝集和分離相關的基因集的抑制（圖5D）。 這些過程已知由於未修復的DNA損傷而隨年齡惡化，特別是在大腦中（Barroso-Vilares等，2020）。 在非大腦組織中，我們發現多種過程富集，其中一些在組織和種群之間重疊，而另一些則沒有，這與衰老是由多種因素控制的複雜過程的觀點一致（圖5—圖補充2）。 總之，這些結果表明，儘管DNA損傷水準升高和DNA損傷和修復機制受損，洞穴魚至少部分地免受其有害影響，並在衰老過程中表現出減少的轉錄變化。

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