背景：自噬和內體通路協同參與乙型肝炎病毒（HBV）病毒體和亞病毒顆粒（SVPs）的生成。 目前尚無確鑿證據證明HBV與外泌體具有相同的生物發生和分泌途徑。 HBV生產與釋放的最後步驟尚未被充分研究。

方法：我們通過GW4869（N，N'-Bis[4-（4,5-二氫-1H-咪唑-2-基）苯基]-3,3'-pht hal amide 二鹽酸鹽）處理，一種抑制神經醯胺介導的膜內陷小分子，檢測HBV病毒體和SVPs的生產與釋放。 通過基因沉默中性鞘磷脂酶（GW4869作用靶點）及調控外泌體釋放的RAB27A/B小GTP酶驗證結果。 採用蛋白質印跡、免疫螢光染色和共聚焦顯微鏡檢測。

結果：GW4869抑制HBV病毒體釋放，導致其與SVPs在肝細胞中積累。 這會觸發內質網應激，導致蛋白激酶B-雷帕黴素靶蛋白激酶（AKT-MTOR）信號通路失活。 GW4869處理增加自噬體形成，通過阻斷自噬體-溶酶體融合損傷自噬體降解。 結果HBsAg更集中於自噬體和晚期核內體/多泡體。 沉默中性鞘磷脂酶得到一致結果。 RAB27A沉默同樣抑制HBV病毒體和SVP分泌，導致其在肝癌細胞中積累。 值得注意的是，GW4869處理及RAB27A/B沉默都增加了LC3+CD63+HBsAg+復合體的形成。

結論：我們的研究結果證明自噬體-晚期核內體/多泡體-外泌體軸調控HBV生產和釋放，揭示amphisome是HBV釋放的潛在平臺。

關鍵詞：自噬過程; 內體運輸; GW4869； HBV； RAB27A/B

引言

HBV引起急性和慢性乙型肝炎，可能導致嚴重肝病。 慢性HBV感染增加肝硬化和肝細胞癌風險。 完整HBV病毒體由核衣殼和含有三種HBsAg的包膜組成。 HBV核衣殼由核心蛋白（HBcAg）組成，其基因組為部分雙鏈環狀DNA。 此外，非感染性亞病毒顆粒（SVPs）以球形和絲狀形式分泌。 然而，調控HBV病毒體和SVPs包膜和釋放的機制尚未完全闡明。

研究發現，感染性HBV病毒體及各類病毒顆粒可通過內體通路釋放。 自噬是HBV組裝的途徑，可通過抑制mTOR激酶（如雷帕黴素）顯著增強病毒生成。 自噬體可能通過溶酶體降解清除細胞成分，但也可能存在未明機制逃逸溶酶體降解並釋放到胞外。 我們的最新研究表明，當內體運輸部分正常時，自噬促進HBV複製和生產，提示晚期核內體/多泡體（MVBs）與自噬體融合形成amphisome促進病毒生成。

外泌體是40-160 nm的細胞外囊泡，來源於晚期核內體/MVBs。 既往研究在HBV感染肝細胞來源的外泌體中檢測到HBV DNA、RNA和蛋白。 因此，抑制細胞外囊泡（EVs）形成和分泌可能阻礙HBV釋放。 GW4869作為MVB抑製劑，通過抑制中性鞘磷脂酶（nSMases）減少外泌體分泌，可減少HBV-DNA或miR-222包裹外泌體的產生。 但GW4869干擾晚期核內體/MVB功能及其對HBV細胞內運輸影響的機制仍不明確。 RAB27A調控外泌體分泌，丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒的細胞逃逸依賴Rab27A，但HBV是否利用該蛋白尚待確認。

本研究系統揭示了GW4869、RAB27A/B在HBV運輸中的機制，提供自噬體-晚期核內體/MVB-外泌體軸和amphisome在HBV複製與釋放中的作用證據。

方法

細胞培養與轉染

本研究採用三種HBV複製細胞模型：穩定表達HBV的HepG2.2.15細胞、轉染HBV質粒的Huh7細胞（暫態模型）和HBV感染的原代人肝細胞（PHH）。 細胞培養條件為37°C，5% CO₂。 HepG2.2.15細胞培養基含10%胎牛血清、雙抗、非必需氨基酸、HEPES和G418。 Huh7細胞培養基含10%胎牛血清。 PHH培養基含胰島素、DMSO、氫化可的松半琥珀酸酯。 質粒或siRNA轉染採用Lipofectamine 2000。

統計分析

數據以均值±標準誤表示，採用GraphPad Prism軟體分析。 兩組比較採用配對t檢驗，單因素實驗採用單因素方差分析。 p<0.05視為有統計學意義。

結果

GW4869處理阻斷HBV病毒體分泌並導致SVPs在細胞內蓄積

為研究外泌體生成抑制對HBV釋放的影響，我們測試了5種靶向內體膜運輸或脂質代謝的小分子化合物（calpeptin， Y27632， GW4869， imipramine， endosidin2）。 其中GW4869處理后細胞內外HBV DNA比值顯著變化。 詳細研究發現，HepG2.2.15、Huh7和PHH細胞在GW4869處理后呈現劑量依賴的細胞內HBV DNA增加和分泌病毒DNA顯著減少。 細胞內HBsAg水準增加，總HBV RNA無明顯變化。 共聚焦顯微鏡和蛋白質印跡顯示HepG2.2.15和Huh7細胞中HBV蛋白表達顯著增加。

GW4869誘導內質網應激和AKT-MTOR信號通路失活

HBV感染誘導內質網應激，觸發細胞自噬促進病毒複製和生產。 我們發現GW4869在HBV感染存在下顯著增加內質網應激標誌物（如Bip、p-EIF2A、ATF6），並導致AKT-MTOR通路失活。 蛋白質印跡顯示，GW4869處理HepG2.2.15細胞后，總AKT、MTOR及核糖體蛋白S6激酶B1（RPS6KB）水準下降，ULK1磷酸化水準升高。

GW4869增加自噬體形成但通過抑制自噬體-溶酶體融合損傷自噬降解

內質網應激和AKT-MTOR通路抑制與細胞自噬誘導相關。 蛋白質印跡顯示夜色春藥網獨家資訊 夜色春藥網半價購買 夜色春藥網配送方式 夜色春藥網全部商品 夜色春藥網必買商品 夜色春藥網LINE直購 夜色春藥網折扣活動，GW4869處理呈劑量依賴性增加SQSTM1和LC3-II蛋白積累。 免疫螢光染色顯示自噬體數量增加但溶酶體降解減少。 Dye Quenched-Red Bovine Serum Albumin追蹤實驗顯示，GW4869顯著減少溶酶體螢光，說明溶酶體降解受損。 LysoTracker Red和acridine orange染色顯示溶酶體酶活性未變，提示GW4869通過阻斷自噬體-溶酶體融合增加自噬體積累。

GW4869處理促進HBV病毒體和SVPs與晚期核內體/MVBs及自噬體的共定位

機制上，GW4869通過抑制神經醯胺介導的膜內陷損傷晚期核內體/MVB形成及外泌體釋放。 研究顯示，GW4869處理降低RAB5A及其效應物EEA1表達，增加溶酶體水準。 免疫螢光顯示RAB5A與HBsAg共定位減少，而CD63與HBcAg共定位增加。 LC3與HBsAg和HBcAg共定位增加，LAMP1與HBsAg共定位減少，表明HBsAg降解受阻導致胞內積累。

LC3+CD63+amphisome樣結構是HBV分泌平臺

amphisomes是自噬體與晚期核內體/MVB融合形成的中間細胞器，參與物質降解和分泌。 我們發現，GW4869處理後CD63+LC3螢光強度增加，表明晚期核內體/MVB與自噬體融合增強形成amphisome。 GW4869處理后HBsAg+amphisome數量增加，提示外泌體釋放受損導致病毒在amphisome積累。 使用PEG沉澱法和外泌體分離試劑盒富集外泌體發現，GW4869處理后外泌體中HBV DNA水準增加，提示HBV與外泌體共用釋放途徑。

靶向ATG5的siRNA實驗證實amphisome對HBV分泌的重要性

通過靶向ATG5基因的siRNA實驗，我們發現ATG5沉默顯著減少amphisome數量並損傷HBV運輸。 即使聯合GW4869處理也無法恢復amphisome數量。 ATG5沉默降低LC3免疫螢光強度及其與HBsAg的共定位，但GW4869處理部分恢復LC3水準和HBsAg共定位。 ATG5沉默不影響CD63免疫螢光強度及其與HBsAg的共定位。 這些發現表明自噬體形成對HBsAg運輸至amphisome至關重要。

nSMase作為GW4869靶點參與HBV複製和運輸

通過靶向鞘磷脂酶2（SMPD2）的siRNA實驗，我們發現SMPD2沉默與GW4869處理效果一致，導致細胞內HBV DNA和HBsAg增加，分泌HBV DNA減少。 SMPD2沉默增加蛋白二硫鍵異構酶（PDI）表達及其與HBsAg共定位，顯示HBsAg滯留內質網。 SMPD2沉默降低RAB5A表達及其與HBsAg的共定位，減少自噬體與溶酶體的共定位，增加HBsAg在自噬體積累。 SMPD2沉默與GW4869處理對HBV複製和運輸的調節具有相似效應，表明GW4869通過中性鞘磷脂酶調控HBV。

RAB27A和-B沉默導致HBsAg在amphisome中積累

通過RAB27A/B基因沉默實驗，我們發現二者均與CD63共定位。 基因沉默后，LC3表達增加，RAB27A沉默顯著增加CD63水準。 聯合氯喹處理顯示，RAB27A/B沉默主要通過抑制自噬降解和分泌而非新自噬體生成導致自噬體積累。 RAB27A沉默增加細胞內HBV DNA減少釋放，RAB27B沉默影響較小。 亞細胞定位顯示，RAB27A/B沉默導致HBsAg向核周聚集。 免疫螢光顯示RAB27A/B沉默增加HBsAg與自噬體共定位，減少其與晚期核內體/MVB共定位。 HBsAg+amphisome比例增加，支援RAB27在amphisome釋放中的作用。

討論

本研究首次揭示amphisome作為HBV分泌

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成並滯留HBV，顯著減少病毒釋放。

在HepG2.2.15細胞中，高水準病毒複製導致HBsAg通過ER-Golgi途徑分泌，而GW4869對此影響較小。 而在pSM2轉染的Huh7細胞和HBV感染的PHH中，GW4869顯著減少HBsAg分泌。 研究還發現鞘磷脂酶2（SMPD2）在GW4869調控HBV運輸和釋放中的關鍵作用。

我們觀察到早期核內體減少並未直接抑制晚期核內體形成，而是改變了其形態。 晚期核內體數量可能通過成熟、降解、迴圈速率的平衡維持穩定。 RAB27A/B作為高序列相似性GTP酶，在HBV運輸和釋放中具有不同功能。 RAB27A/B沉默導致HBsAg在amphisome中積累，但只有RAB27A沉默抑制HBV DNA和HBsAg分泌。 該發現與Matias等研究一致，顯示RAB27A參與膜融合和貨物釋放，RAB27B可能調控MVB運動。

既往研究顯示amphisomes介導細胞貨物運輸至溶酶體降解，其非常規分泌功能僅見於神經退行性疾病和肺上皮細胞分泌。 本研究首次可視化HBsAg與amphisome的關聯，GW4869處理及RAB27A/B沉默導致HBsAg+LC3+CD63+結構積累，證實amphisome在HBV複製和釋放中的作用。 總之，自噬-晚期核內體/MVB-外泌體軸調控HBV複製和釋放，amphisome作為HBV釋放平臺具有重要作用。