名偵探柯南 純黑的惡夢 預告片2016名偵探柯南 純黑的惡夢 預告片-到威秀看電影只要6折耶！
2016/08/25 23:08
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最近，不死心的科學家們又盯上了蠶寶寶，既然它們會吐絲，不如吐點蜘蛛絲？
紫外線照射下的蠶繭，左邊藍色的是正常蠶繭，右邊綠色的是轉基因蠶繭。圖片來源：克雷格生物技術實驗室
IEEE中國是DeepTech深科技的戰略合作夥伴，想要獲得最新的科技資訊和會議信息，敬請關注IEEE中國。
拉伸曲線示意圖（A）與蜘蛛的曳絲（紅色）和粘絲（藍色）拉伸曲線（B），圖片來源：F. Omenetto, et al. Science, 329, 2010,528-531
在材料力學性能測試中，最為經典的測試手段就是拉伸實驗。這個實驗能給予我們至少四個非常重要的數據：彈性模量（又被稱為楊氏模量）、強度、應變與韌性。
電影推薦 鑒於蜘蛛絲優異的材料性能，科學家們從十幾年前就開始尋找大規模量產的方式。既然蜘蛛拒絕合作，那就只能「曲線救國」。早在2000年，就有科學家將蜘蛛身上產生蛛絲蛋白的基因移植到山羊身上，然後從羊奶中提取蛛絲。但這些「腦洞大開」的方法最終都沒能實際應用。
介紹完基礎知識，我們可以來看看蜘蛛絲的拉伸曲線。科學家們發現，蜘蛛絲實際上分為兩類，一種是用於支撐蜘蛛網框架結構的曳絲（Drag Line），另一種為輪輻狀的粘絲（Viscid Line）。這兩種材料具有非常不同的力學性能特徵。
1、Florence Teulé, Yun-Gen Miao, Bong-Hee Sohn et al., Silkworms transformed with chimeric silkworm/spider silk genes spin composite silk fibers with improved mechanical properties, Proceedings of the National Academy of Sciences 109 (3), 923 (2012).
航海王劇場版有哪些長按關注
可以看到，蜘蛛的曳絲具有與常見的高強鋼相當的強度，而蜘蛛絲的密度僅約為鋼的1/5到1/6，因而有人說，同等重量的蜘蛛絲是鋼的五倍。
實事求是的說，美國杜邦公司於上個世紀五十年代研發出的凱夫拉縴維幾乎已經可以看做是現代防彈背心的代名詞。但是，蜘蛛絲的韌性幾乎達到了凱夫拉縴維的三倍。之前我們已經提到，韌性的單位是（MJ/m3，即單位體積吸收的能量）。這意味著，如果用蜘蛛絲製作同樣大小的防彈背心，其在破裂之前吸收的能量將達到凱夫拉的三倍，這意味著由蜘蛛絲製成的防彈背心將具有更為優秀的防彈能力，從而可以挽救更多戰士或者是執法人員的生命。
文筆好，懂科技，稿酬優
蜘蛛絲與常見人造纖維及結構材料力學性能 ，表格來源：F. Omenetto, et al. Science, 329, 2010,528-531
可以估算一下，攔下一架正在以巡航速度飛行（920km/h）的波音747飛機（140噸），需要一張厚度為鉛筆粗細(0.5 厘米)，面積至少為6100平方米（略小於一個標準足球場）的蜘蛛網才行。
正是由於蜘蛛絲所具有的超高韌性，有科學家樂打趣道，「用鉛筆桿一樣粗細的蜘蛛絲來結成網，那麼這張網可以攔截住一架飛行當中的波音747客機」。
DeepTech深科技 麻省理工科技評論獨家合作
DeepTech深科技
從相應的拉伸曲線可以看出，如圖1(B)所示，曳絲強度以及彈性模量要比粘絲高出許多，但是延伸率（~0.3）卻要比粘絲（~2.7）低得多。粘絲的最大應變可達2.7，這是一個驚人的數字：這意味著粘絲可以一直伸長到其初始長度的3.7倍而不斷裂。
3、Fiorenzo G. Omenetto and David L. Kaplan, New Opportunities for an Ancient Material, Science 329 (5991), 528 (2010).
另外，美國猶他州立大學的蘭迪劉易斯（Randy Lewis）教授則另闢蹊徑，將表達蜘蛛絲蛋白質的DNA序列轉移到了山羊的乳腺細胞中，從而實現在轉基因山羊的羊奶中獲取蜘蛛絲蛋白。但是目前來看，轉基因家蠶是最有優勢的一種手段。文章開頭提到的克雷格生物技術實驗室採用的正是這一手段，試圖大規模地制備性能出眾的蜘蛛絲。
圖片來源：Microsoft
可能有人會好奇，為什麼不能像養蠶一樣大規模養蜘蛛呢？蠶寶寶只要有桑葉吃，並不介意擠在一起，而蜘蛛則不然，喜愛獨居的它們，在遇到同類時會相互殘殺。所以，以天然方式大規模生產蜘蛛絲是行不通的。
在下圖A中的拉伸曲線的示意圖所示，其中橫坐標是應變（ε=△ L / L ，是一個無量綱的數值），縱坐標是強度（單位一般是MPa或者GPa）。在拉伸曲線的初始線性階段的斜率，是這種材料的近期 電影彈性模量。一種材料在拉伸曲線中所達到的最高強度作為這個材料的強度（單位也是MPa或者GPa），而材料的最大應變值則等於這種材料斷裂時的延伸率。而材料的韌性（單位是MJm-3），則由拉伸曲線下方的面積衡量。
一個更為直觀的例子來自美國的自然歷史博物館。2009年9月，美國自然歷史博物館展出了一塊約3.3米寬，1.2米高的蜘蛛絲織錦，如圖2所示。這幅尺寸不算驚人的織錦是由超過80人在四年裡收集了1百萬隻黃金球蛛如果這世界貓消失了 電影線上看（Golden Orb Spider）織的絲才編製而成。顯然，如果將來蜘蛛絲真的開始大範圍地用作防彈衣的材料，人們必須要像電影中的蜘蛛俠彼得·帕克一樣，擁有高效生產蜘蛛絲的「魔法」。
分享至朋友圈才是義舉
我們可以看到，儘管蜘蛛絲纖維的強度不及高強的碳纖維以及一些其他的合成纖維（如芳綸，即凱夫拉），但是其韌性則遠遠優於這些主要用於抗衝擊材質的纖維。事實上，目前尚未有任何人造纖維材料能達到這一數值。而說起凱夫拉，恐怕大家最為耳熟能詳的應用就是用作防彈背心的凱夫拉裝甲。
凱夫新名偵探柯南線上看拉護甲。圖片來源：eBay
轉基因家蠶破繭成蛾，圖片來源：克雷格生物技術實驗室
2、Limin Huang, Huanting Wang, Cheryl Y. Hayashi et al., Single-strand spider silk tem名偵探柯南世良真純出現集數plating for the formation of hierarchically ordered hollow mesoporous silica fibers, Journal of Materials Chemistry 13 (4), 666 (2003).
簡單來說，蜘蛛絲具有獨特的高強度與延展性。其韌性之高，大顯神威級別讓所有的人造橡膠、纖維均相形見絀。這種性質的獨特之處在於，在常見的材料之中，強度與延展性常常是互斥的。
我們先不去質疑織出這張網的用途，也假裝可以無視織出這張網需要的預算，最大的問題是，上哪去收集這麼多蜘蛛絲來織成這樣的網？
很遺憾，現實生活中並不存在像蜘蛛俠彼得帕克這樣可以隨心所欲「biu biu biu」地短時間射出一團蜘蛛網的超級英雄。蜘蛛不比家蠶，它的生活習性就決定了它無法像家蠶一樣默默地吐絲到天荒地老。絕大多數蜘蛛屬於肉食性動物，需要吃很多昆蟲才能結少量的網。
同時其同類相食的特點也決定了它難以被高密度養殖。同時，蜘蛛吐絲的速率也遠稱不上勤快。即使大家都同意蜘蛛絲具有無比優異的性如果這世界貓消失了txt能，但是制約其商業化應用最大的障礙，正是蜘蛛絲本身低下的制備效率。
圖2. 在美國自然歷史博物館展出的蜘蛛絲織錦（Tapestry）（圖片來源：Wired）
說起蜘蛛絲，大家應該都不會陌生。在漫威系列電影《蜘蛛俠》裡，蜘蛛俠飛簷走壁打反派救女神，靠的就是他那無比神奇，極具彈性，又可任意伸長變形的蜘蛛絲。當然，現實生活中的蜘蛛絲無法與電影中的相提並論，但是其優異的力學性能依然吸引了許多科學家的注意。那麼問題來了，為什麼他們要選擇蜘蛛絲呢？
如何才能高效的生產性能優異的蜘名偵探柯南純黑的惡夢線上看蛛絲呢？
早期的研究表明，蜘蛛絲本質上是複雜的蛋白質分子。蜘蛛絲蛋白包含了結晶與非結晶結構，前者增加了蜘蛛絲的物理強度，後者則增加了蜘蛛絲的延展性。同時，部分的內在結構與蜘蛛絲存在一定的取向關係，而這些取向關係也在一定程度上使得蜘蛛絲能具有優異的延展性能。
另外，研究者們還發現蜘蛛吐絲的速率可能在一定程度上改變了分子的微觀取向，從而會影響蛛絲的力學性能。這些複雜的蛋白質分子以及其內在的微觀取向關係使得人工化學合成性能相當的纖維困難重重。專注開腦洞的科學家們繼續在這個問題上繼續發揮了他們天馬行空般的想像力。既然實驗室做不出來，蜘蛛也很難搞定，那麼有沒有辦法讓蜘蛛像家蠶那樣吐絲呢？
除了具有優異的力學性能之外，蜘蛛絲另一個為研究人員青睞的原因在於其主要成分為生物蛋白，因而具有非常好的生物相容性。因此，蜘蛛絲的潛在應用還包括生物醫藥材料，例如用於傷口縫合名偵探柯南線上看動畫線，干細胞生長的支架材料，生物黏合劑甚至肌腱韌帶等。
正是在這個時候，基因工程開始大放異彩。早在2011年的一篇發表於美國科學院院刊的一篇文章中，研究者們就通過轉基因技術，使得普通的家蠶可以分泌出具有與蜘蛛絲相同蛋白成分的蠶絲，從而大大地提高了蜘蛛絲的產量。
圖片來源：360百科
圖片來源：Listverse
值得一提的是，我國科學家復旦大學的邵正中教授發現，家蠶吐出的絲在一定條件下也可能具備與蜘蛛絲相媲美的強韌度。當時，學術界普遍認為，蠶絲的性能要弱於蜘蛛絲，儘管蠶絲來源要比蜘蛛絲容易得多，但是仍然未能引起廣泛的關注。邵教授首先注意到蠶絲的力學性能與家蠶的吐絲行為（比如吐絲速度，頭部轉動等）有關。通過組織家蠶頭部的轉動，並且調節家蠶的吐絲速率，可以得到韌性與蜘蛛曳絲相媲美的蠶絲。邵教授的這一發現無疑為高效制備高性能生物纖維提供了一個新的思路。
參考文獻：
美國密歇根州的克雷格生物技威 秀 電影術實驗室（Kraig Biocraft Laboratory）最近搞了一個大新聞：他們與美國陸軍將開始對「龍絲」（Dragon Silk）進行實測，這是一種利用轉基因技術開發的新一代超高韌性的纖維。這種纖維的獨特之處在於，它實際上是由轉基因的家蠶吐出的蜘蛛絲。公司在一份聲明中稱，在所有目前已知的材料中，「龍絲」纖維的韌性是最高的。如果測試成功，「龍絲」或許在不久的將來替代凱夫拉（Kevlar）纖維，用於製作性能更為優異，而且更為輕薄的防彈衣。
可以這麼理解，強度是一個物質抵抗變形的能力（剛度），延展性是一個物質順從變形的能力（柔度）。目前看來，材料領域似乎也只有蜘蛛絲存在這樣剛柔並濟的特點，因而不得不讓科學家對它高看一眼。
另一方面，曳絲儘管其最大應變與粘絲相比似乎少得可憐，但是0.3的應變依然是一個十分優秀的成績，甚至已經超過了絕大多數包括金屬在內的金屬材料。表1列出了蜘蛛的曳絲，粘絲與其他一些常見生物以及結構材料之間的比較。
4、Eileen S. Lintz and Thomas R. Scheibel, Dragline, Egg Stalk and Byssus: A Comparison of Outstanding Protein Fibers and Their Potential for Developing New Materials, Advanced Functional Materials 23 (36), 4467 (2013).
5、Zhengzhong Shao and Fritz Vollrath, Materials: Surprising strength of silkworm silk, Nature 418 (6899), 741 (2002).
6、Fritz Vollrath, Bo Madsen, 看 電影and Zhengzhong Shao, The effect of spinning conditions on the mechanics of a spider's dragline silk, Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences 268 (1483), 2339 (2001).
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蜘蛛樓下的房客 李杏絲強在何處？
聯繫：deeptech@mittrchina.com
編者按：蜘蛛絲是一種異常堅韌的材料，這一點早已深入人心。有「生物鋼材」之稱的蜘蛛絲是已知生物材料中強度最高的。蛛絲雖好，但其產量一直是個很大的問題。
MIT Technology Review 中國唯一版權合作方，任何機構及個人未經許可，不得擅自轉載及翻譯。
圖片來源：58pic
圖片來源：Fox News
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凱芙拉(Kevlar)是杜邦公司使用在芳族聚酰胺名偵探柯南 純黑的惡夢 預告片類有機纖維上的註冊商標，這一類纖維具有極高的強度，因此常用於製作繩索、電纜、塗漆織物、防彈背心等。
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拉伸曲線示意圖（A）與蜘蛛的曳絲（紅色）和粘絲（藍色）拉伸曲線（B），圖片來源：F. Omenetto, et al. Science, 329, 2010,528-531
在材料力學性能測試中，最為經典的測試手段就是拉伸實驗。這個實驗能給予我們至少四個非常重要的數據：彈性模量（又被稱為楊氏模量）、強度、應變與韌性。
電影推薦 鑒於蜘蛛絲優異的材料性能，科學家們從十幾年前就開始尋找大規模量產的方式。既然蜘蛛拒絕合作，那就只能「曲線救國」。早在2000年，就有科學家將蜘蛛身上產生蛛絲蛋白的基因移植到山羊身上，然後從羊奶中提取蛛絲。但這些「腦洞大開」的方法最終都沒能實際應用。
介紹完基礎知識，我們可以來看看蜘蛛絲的拉伸曲線。科學家們發現，蜘蛛絲實際上分為兩類，一種是用於支撐蜘蛛網框架結構的曳絲（Drag Line），另一種為輪輻狀的粘絲（Viscid Line）。這兩種材料具有非常不同的力學性能特徵。
1、Florence Teulé, Yun-Gen Miao, Bong-Hee Sohn et al., Silkworms transformed with chimeric silkworm/spider silk genes spin composite silk fibers with improved mechanical properties, Proceedings of the National Academy of Sciences 109 (3), 923 (2012).
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可以看到，蜘蛛的曳絲具有與常見的高強鋼相當的強度，而蜘蛛絲的密度僅約為鋼的1/5到1/6，因而有人說，同等重量的蜘蛛絲是鋼的五倍。
實事求是的說，美國杜邦公司於上個世紀五十年代研發出的凱夫拉縴維幾乎已經可以看做是現代防彈背心的代名詞。但是，蜘蛛絲的韌性幾乎達到了凱夫拉縴維的三倍。之前我們已經提到，韌性的單位是（MJ/m3，即單位體積吸收的能量）。這意味著，如果用蜘蛛絲製作同樣大小的防彈背心，其在破裂之前吸收的能量將達到凱夫拉的三倍，這意味著由蜘蛛絲製成的防彈背心將具有更為優秀的防彈能力，從而可以挽救更多戰士或者是執法人員的生命。
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蜘蛛絲與常見人造纖維及結構材料力學性能 ，表格來源：F. Omenetto, et al. Science, 329, 2010,528-531
可以估算一下，攔下一架正在以巡航速度飛行（920km/h）的波音747飛機（140噸），需要一張厚度為鉛筆粗細(0.5 厘米)，面積至少為6100平方米（略小於一個標準足球場）的蜘蛛網才行。
正是由於蜘蛛絲所具有的超高韌性，有科學家樂打趣道，「用鉛筆桿一樣粗細的蜘蛛絲來結成網，那麼這張網可以攔截住一架飛行當中的波音747客機」。
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從相應的拉伸曲線可以看出，如圖1(B)所示，曳絲強度以及彈性模量要比粘絲高出許多，但是延伸率（~0.3）卻要比粘絲（~2.7）低得多。粘絲的最大應變可達2.7，這是一個驚人的數字：這意味著粘絲可以一直伸長到其初始長度的3.7倍而不斷裂。
3、Fiorenzo G. Omenetto and David L. Kaplan, New Opportunities for an Ancient Material, Science 329 (5991), 528 (2010).
另外，美國猶他州立大學的蘭迪劉易斯（Randy Lewis）教授則另闢蹊徑，將表達蜘蛛絲蛋白質的DNA序列轉移到了山羊的乳腺細胞中，從而實現在轉基因山羊的羊奶中獲取蜘蛛絲蛋白。但是目前來看，轉基因家蠶是最有優勢的一種手段。文章開頭提到的克雷格生物技術實驗室採用的正是這一手段，試圖大規模地制備性能出眾的蜘蛛絲。
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在下圖A中的拉伸曲線的示意圖所示，其中橫坐標是應變（ε=△ L / L ，是一個無量綱的數值），縱坐標是強度（單位一般是MPa或者GPa）。在拉伸曲線的初始線性階段的斜率，是這種材料的近期 電影彈性模量。一種材料在拉伸曲線中所達到的最高強度作為這個材料的強度（單位也是MPa或者GPa），而材料的最大應變值則等於這種材料斷裂時的延伸率。而材料的韌性（單位是MJm-3），則由拉伸曲線下方的面積衡量。
一個更為直觀的例子來自美國的自然歷史博物館。2009年9月，美國自然歷史博物館展出了一塊約3.3米寬，1.2米高的蜘蛛絲織錦，如圖2所示。這幅尺寸不算驚人的織錦是由超過80人在四年裡收集了1百萬隻黃金球蛛如果這世界貓消失了 電影線上看（Golden Orb Spider）織的絲才編製而成。顯然，如果將來蜘蛛絲真的開始大範圍地用作防彈衣的材料，人們必須要像電影中的蜘蛛俠彼得·帕克一樣，擁有高效生產蜘蛛絲的「魔法」。
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我們可以看到，儘管蜘蛛絲纖維的強度不及高強的碳纖維以及一些其他的合成纖維（如芳綸，即凱夫拉），但是其韌性則遠遠優於這些主要用於抗衝擊材質的纖維。事實上，目前尚未有任何人造纖維材料能達到這一數值。而說起凱夫拉，恐怕大家最為耳熟能詳的應用就是用作防彈背心的凱夫拉裝甲。
凱夫新名偵探柯南線上看拉護甲。圖片來源：eBay
轉基因家蠶破繭成蛾，圖片來源：克雷格生物技術實驗室
2、Limin Huang, Huanting Wang, Cheryl Y. Hayashi et al., Single-strand spider silk tem名偵探柯南世良真純出現集數plating for the formation of hierarchically ordered hollow mesoporous silica fibers, Journal of Materials Chemistry 13 (4), 666 (2003).
簡單來說，蜘蛛絲具有獨特的高強度與延展性。其韌性之高，大顯神威級別讓所有的人造橡膠、纖維均相形見絀。這種性質的獨特之處在於，在常見的材料之中，強度與延展性常常是互斥的。
我們先不去質疑織出這張網的用途，也假裝可以無視織出這張網需要的預算，最大的問題是，上哪去收集這麼多蜘蛛絲來織成這樣的網？
很遺憾，現實生活中並不存在像蜘蛛俠彼得帕克這樣可以隨心所欲「biu biu biu」地短時間射出一團蜘蛛網的超級英雄。蜘蛛不比家蠶，它的生活習性就決定了它無法像家蠶一樣默默地吐絲到天荒地老。絕大多數蜘蛛屬於肉食性動物，需要吃很多昆蟲才能結少量的網。
同時其同類相食的特點也決定了它難以被高密度養殖。同時，蜘蛛吐絲的速率也遠稱不上勤快。即使大家都同意蜘蛛絲具有無比優異的性如果這世界貓消失了txt能，但是制約其商業化應用最大的障礙，正是蜘蛛絲本身低下的制備效率。
圖2. 在美國自然歷史博物館展出的蜘蛛絲織錦（Tapestry）（圖片來源：Wired）
說起蜘蛛絲，大家應該都不會陌生。在漫威系列電影《蜘蛛俠》裡，蜘蛛俠飛簷走壁打反派救女神，靠的就是他那無比神奇，極具彈性，又可任意伸長變形的蜘蛛絲。當然，現實生活中的蜘蛛絲無法與電影中的相提並論，但是其優異的力學性能依然吸引了許多科學家的注意。那麼問題來了，為什麼他們要選擇蜘蛛絲呢？
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另外，研究者們還發現蜘蛛吐絲的速率可能在一定程度上改變了分子的微觀取向，從而會影響蛛絲的力學性能。這些複雜的蛋白質分子以及其內在的微觀取向關係使得人工化學合成性能相當的纖維困難重重。專注開腦洞的科學家們繼續在這個問題上繼續發揮了他們天馬行空般的想像力。既然實驗室做不出來，蜘蛛也很難搞定，那麼有沒有辦法讓蜘蛛像家蠶那樣吐絲呢？
除了具有優異的力學性能之外，蜘蛛絲另一個為研究人員青睞的原因在於其主要成分為生物蛋白，因而具有非常好的生物相容性。因此，蜘蛛絲的潛在應用還包括生物醫藥材料，例如用於傷口縫合名偵探柯南線上看動畫線，干細胞生長的支架材料，生物黏合劑甚至肌腱韌帶等。
正是在這個時候，基因工程開始大放異彩。早在2011年的一篇發表於美國科學院院刊的一篇文章中，研究者們就通過轉基因技術，使得普通的家蠶可以分泌出具有與蜘蛛絲相同蛋白成分的蠶絲，從而大大地提高了蜘蛛絲的產量。
圖片來源：360百科
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值得一提的是，我國科學家復旦大學的邵正中教授發現，家蠶吐出的絲在一定條件下也可能具備與蜘蛛絲相媲美的強韌度。當時，學術界普遍認為，蠶絲的性能要弱於蜘蛛絲，儘管蠶絲來源要比蜘蛛絲容易得多，但是仍然未能引起廣泛的關注。邵教授首先注意到蠶絲的力學性能與家蠶的吐絲行為（比如吐絲速度，頭部轉動等）有關。通過組織家蠶頭部的轉動，並且調節家蠶的吐絲速率，可以得到韌性與蜘蛛曳絲相媲美的蠶絲。邵教授的這一發現無疑為高效制備高性能生物纖維提供了一個新的思路。
參考文獻：
美國密歇根州的克雷格生物技威 秀 電影術實驗室（Kraig Biocraft Laboratory）最近搞了一個大新聞：他們與美國陸軍將開始對「龍絲」（Dragon Silk）進行實測，這是一種利用轉基因技術開發的新一代超高韌性的纖維。這種纖維的獨特之處在於，它實際上是由轉基因的家蠶吐出的蜘蛛絲。公司在一份聲明中稱，在所有目前已知的材料中，「龍絲」纖維的韌性是最高的。如果測試成功，「龍絲」或許在不久的將來替代凱夫拉（Kevlar）纖維，用於製作性能更為優異，而且更為輕薄的防彈衣。
可以這麼理解，強度是一個物質抵抗變形的能力（剛度），延展性是一個物質順從變形的能力（柔度）。目前看來，材料領域似乎也只有蜘蛛絲存在這樣剛柔並濟的特點，因而不得不讓科學家對它高看一眼。
另一方面，曳絲儘管其最大應變與粘絲相比似乎少得可憐，但是0.3的應變依然是一個十分優秀的成績，甚至已經超過了絕大多數包括金屬在內的金屬材料。表1列出了蜘蛛的曳絲，粘絲與其他一些常見生物以及結構材料之間的比較。
4、Eileen S. Lintz and Thomas R. Scheibel, Dragline, Egg Stalk and Byssus: A Comparison of Outstanding Protein Fibers and Their Potential for Developing New Materials, Advanced Functional Materials 23 (36), 4467 (2013).
5、Zhengzhong Shao and Fritz Vollrath, Materials: Surprising strength of silkworm silk, Nature 418 (6899), 741 (2002).
6、Fritz Vollrath, Bo Madsen, 看 電影and Zhengzhong Shao, The effect of spinning conditions on the mechanics of a spider's dragline silk, Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences 268 (1483), 2339 (2001).
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